Técnicas Histológicas

Preparação de tecidos Biológicos para  a visualização em microscópio de luz

Imagem 1: Microscópio de luz (lojaroster) 

A histologia é a ciência que estuda os tecidos biológicos desde de sua formação até o seu funcionamento, esses tecidos são constituídos por grupos característicos de células que são extremamente pequenas, tornando assim a histologia dependente de microscópio e de lâminas, os microscópios mais utilizados nas aulas de histologia são os microscópios de luz  (microscópio óptico ou fototônico). As lâminas histológicas por sua vez são essenciais para a histologia, pois é através delas junto ao microscópio que identificamos a características dos tecidos, elas também são muito utilizadas em pesquisas químicas, fisiológicas, imunológicas e patológicas, assim,  com o preparo adequado das lâminas os estudos dentro dessas áreas apresentam um resultado mais eficaz e diversos avanços para ciência. O conjunto de procedimentos necessários para a preparação de amostras (tecidos e órgãos) para o microscopia de luz é chamado de histotecnologia e o texto abaixo explica de maneira simples os procedimentos e etapas da preparação de lâminas.

1. Obtenção do Material

A primeira etapa do processo é a coleta do material que se caracteriza como a ação na qual uma amostra biológica é retirada de um organismo através de biópsias, procedimentos cirúrgicos ou necrópsias.

2. Fixação

Logo após a obtenção do material os fragmentos de tecido e órgãos devem ser submetidos a fixação. Essa fase é necessária pelas seguintes questões:

• Impedir a autólise dos tecidos;
• Evitar a proliferação bacteriana;
• Preservar os tecidos para futuras colorações;
• Parar o Metabolismo celular, mantendo o conteúdo bioquímico e preservando antígenos;
• Deixar o tecido o mais próximo da situação in-vivo.

A fixação pode ser feita por métodos físicos ou químicos. A fixação física promove a conservação da amostra através de seu aquecimento (coagula proteínas incluindo as enzimas autolíticas e dissolve os lipídeos) ou resfriamento (retarda o processo de necrose e autólise)  e é utilizada com menos frequência. Na fixação química os tecidos são imersos em fixadores  de agentes desnaturantes ou agentes estabilizadores de moléculas formando pontes com moléculas vizinhas. Os laboratórios usam com mais frequência misturas fixadoras ex: Carnoy, Bouin, B5.

3. Clivagem

Clivagem é o processo de redução de tamanho dos fragmentos fixados, assim a penetração do fixador e das substâncias adicionadas posteriormente é facilitada.

A etapa abaixo é necessária apenas para tecidos ricos em cálcio como o tecido ósseo, caso contrário continua-se com o processamento.

4. Descalcificação

Para a observação do tecido ósseo ou diagnóstico de algumas patologias deve-se proceder a descalcificação que consiste na retirada do excesso de cálcio de alguns tecido biológicos, porém, para a escolha do método é necessário analisar alguns fatores como (Grau de mineralização do tecido, a coloração a ser empregada, tipo de fixador utilizado entre outros).

4. Processamento

Reúne procedimentos que visam substituir a água existente nos tecidos por um meio mais sólido, assim o tecido terá uma textura mais rígida o que facilitará a sua microtomia subsequentemente. Em laboratórios de anatomia patológica geralmente o OCT é mais utilizado para a congelação, a parafina por sua vez é mais utilizada para amostras fixadas quimicamente. Quando a parafina é utilizada no processo são necessárias as etapas de: desidratação, clarificação ou diafanização e a infiltração.

1. Desidratação: Como o os organismos vivos possuem uma grande quantidade de água em suas estruturas a parafina não consegue penetrar nesses organismos sem a desidratação. A desidratação consiste na remoção da  água dos organismos por meio de agentes desidratantes, como o Etanol que é o mais comum.O tecido deve passar por banhos de concentrações crescentes de álcool, seguidos por banhos de álcool absoluto, sendo de 1 hora a 1 hora e 30 minutos para amostras comuns.

1. Clarificação ou Diafanização: Essa etapa só deve ser iniciada após a remoção completa da água através da desidratação. A clarificação visa remover os alcoóis do tecido utilizados na etapa da desidratação por meio de agentes clarificadores, dentre eles o mais utilizado é o Xilol. São dados dois banhos de xilol nas amostras.

1. Infiltração: Consiste no preenchimento das cavidades teciduais pela parafina. É necessário que essa parafina esteja em seu estado líquido entre 56° a 60°C para que o resultado seja mais eficiente.  Geralmente são dados 2 banhos de parafina líquida

Obs: O processamento pode ser feito de forma automática ou de forma manual dependendo do laboratório.

5. Inclusão

A inclusão consiste na adição do tecido infiltrado em fôrmas pequenas com parafina líquida ou algumas resinas de plástico e posteriormente na formação de blocos que serão primordiais para a microtomia. Essa etapa pode ser feita com as centrais de inclusão ou com a parafina retirada diretamente da estufa.

Obs: Utiliza-se resina de plástico geralmente para microscopia eletrônica e a parafina para a microscopia de luz. 

Imagem 2: leicabiosystems

6. Microtomia

Depois da inclusão, os blocos de parafina estão prontos para serem fatiados pelo micrótomo; esses equipamentos são capazes de realizar cortes que variam de 1 a 60 micrômetros.  A microtomia também pode ser realizada em espécimes congelados,  seja nitrogênio líquido por congelamento ou por congelamento rápido em um braço de um criostato.

7. Coloração

A coloração de tecidos é a fase destinada a tornar os tecidos visíveis ao microscópio com o auxilio de soluções corantes. A Hematoxilina (corante básico) se ligará as substâncias químicas  ácidas presentes no núcleo das células e a Eosina (corante ácido) que se ligará as partes básicas presentes nos tecidos celulares, essas são as colorações mais utilizadas em todo mundo. É a coloração que permite a visualização geral das estruturas gerais realçando o núcleo em azul e o citoplasma em róseo.

Para que a coloração tenha bons resultados são essenciais mais duas etapas. 

Desparafinização: Etapa necessária para a retirada da parafina da lâmina. São dados 3 banhos de xilol por 3 minutos cada. Se a parafina não for retirada adequadamente a coloração será dificultada. 

Hidratação: A hidratação é necessária para retirar o xilol dos tecidos histológicos e deve ser iniciada com 2 banhos de álcool absoluto e decrescendo para banhos de 95%, 70% até chegar a água destilada.Quando o corante é diluído em álcool deve se interromper a hidratação em álcool 70%.

8. Selagem

Existem vários meios de selagem permanente, um dele é a Goma de Damar que apresenta baixo custo e promove um excelente resultado final, esse meio de selagem é diluído em xilol, o procedimento consiste na adição de uma gota de goma em cada lâmina e logo após esta é recoberta por uma lamínula. 

9. Observação ao Microscópio

O uso de lamínula é essencial pois a óptica dos microscópios atuais depende do uso de lamínulas para que a distancia de trabalho das objetivas seja correta, além disso a  lamínula torna as superfícies a serem analisadas planas.

Referências Bibliográficas:

• TÉCNICAS Histológicas - Uma abordagem Prática. Direção de Fiocruz. Realização de Instituto Oswaldo Cruz. S.i: Laboratório de Patologia e Serviço e Produção e Tratamento de Imagem, 2012. Son., color. Disponível em: <https://www.youtube.com/watch?v=RlyTg64AT9E>. Acesso em: 01 fev. 2016.

• YOUNG, B.; LOWE, J. S.; STEVENS, A. Wheater´s: Histologia Funcional: Texto e Atlas em Cores. Editora Elsevier. 2007.

• JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia Básica. 12.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013.p.2-4.